I.1. ETAT DE L'ART - CADRE GENERAL
I.2. ETUDE DE LA PHOTOADAPTATION EN MILIEU SIMULE
       I.2.1. Définir des contrôles adaptés
      I.2.2. Reconstituer au laboratoire un environnement complexe pour expérimenter
      I.2.3. Les microphénomènes sont-ils importants pour les flux résultants ?
I.3. MECANISMES DE LA PHOTOSYNTHESE
I.4. OBJECTIFS SCIENTIFIQUES
      I.4.1. Définition concertée des protocoles expérimentaux pertinents
      I.4.2. Déterminer les mécanismes mis en place lors de la photoadaptation
      I.4.3. Concevoir, tester et valider des modèles de faible dimension (3 ou 4 variables)
      I.4.4. Retour au système réel: couplage physique-biologie

La photoadaptation est un des processus qui permettent aux cellules phytoplanctoniques autotrophes d'optimiser leur développement dans un environnement où les conditions de croissance sont physiologiquement sub-optimales (photoadaptation est à prendre ici dans sa connotation phénotypique, et non génotypique). De son efficacité dépend le flux de carbone associé à la production primaire. L'étude in situ de ce processus est extrêmement complexe car il intègre l'influence de nombreux facteurs que l'on ne maîtrise pas, dont le plus étudié a été le flux de photons. La température et les éléments nutritifs, notamment le nitrate, jouent également un rôle prépondérant dans la régulation de la synthèse (photoadaptation) et de la composition (adaptation chromatique) du pool pigmentaire (Cullen et al. 1993) . Même au laboratoire, les études expérimentales se sont essentiellement cantonnées à l'effet de la lumière (Marra 1978a; Marra 1978b) , et les modèles de photosynthèse utilisés ne font généralement intervenir que ce dernier paramètre (Cullen et Lewis 1988; Lande et Lewis 1989).

Cette simplification est en contradiction avec les conditions qui prévalent dans la plupart des régimes hydrodynamiques marins, où concomitance et variabilité des facteurs de croissance sont la règle: les organismes marins sont soumis simultanément , non pas à un seul, mais à plusieurs limitations de natures différentes (les principaux étant lumière, nutriment et température) dont l'effet résultant peut être complexe, et qui, en outre, peuvent fluctuer au gré des processus d'advection diffusion (Lewis et al. 1984) .

 La manifestation principale de la photoadaptation est une modification du rapport carbone/chlorophylle, q=C/Chla (Geider 1987). La plasticité importante de ce rapport, souvent considéré comme constant, est primordiale au moins à deux points de vue. Premièrement, considérer q invariable conduit à biaiser la mesure du carbone autotrophe in situ à partir de celle de la chlorophylle, actuellement la seule dont on dispose pour estimer couramment la biomasse des producteurs autotrophes dans la colonne d'eau. Deuxièmement, comme la teneur en chlorophylle détermine en grande partie l'absorption de photon à une profondeur donnée, sa dynamique doit être déterminée avec précision pour obtenir une estimation fiable de la fixation de carbone intégrée sur la verticale et dans le temps.

Malgré cela, la photoadaptation est largement sous-représentée dans les modèles de réseau trophique. Ces derniers sont nécessairement simplifiés à cause de considérations restrictives liées à la représentation déterministe de systèmes complexes (surparamétrisation, incertitude sur les processus et les paramètres, validation incertaine, etc.). Comme la pratique de la modélisation est rapide comparativement aux avancées expérimentales (et moins chère aussi), la résolution de problèmes conceptuels complexes a presque toujours été conduite sur l'improvisation de relations empiriques (typiquement loi du minimum, loi multiplicative, etc.), non validées par l'expérience, car non étudiées ni testées (Sciandra et al. 1997) . Les modèles récents qui prennent en compte un couplage structurel des effets simultanés de l'azote, de la lumière et de la température sont pour l'essentiel confrontés à des mesures acquises à l'état stable (Flynn et al. 2001; Geider et al. 1997; Geider et al. 1998; Zonneveld 1998) . Il faut dire que l'approche expérimentale portant sur des systèmes multiparamétriques et instationnaires (Davidson et al. 1999) s'est faiblement développée par le passé, compte-tenu des difficultés inhérentes à l'étude des organismes planctoniques d'une façon générale, et à celles d'exercer un contrôle complexe, prolongé et intelligent sur ces mêmes organismes, en particulier. L'apparition d'outils propres au développement d'automates permet d'envisager maintenant des expériences d'un autre type, plus adaptées à l'étude des processus non linéaires.

  Rhodomonas salina. Short term adaptation kinetics of internal Chl a (●) and Phycoerythrin (○) to a step change of dilution rate in a chemostat culture submitted to constant light. Both the amplitude and the rate of adjustment are more important for the PE pool, compared to the Chl a one, suggesting a higher mobility for the former in a nitrogen varying environment

I.2.1. Définir des contrôles adaptés

Ces considérations d'ordre général nous incitent à penser que les approches expérimentales et théoriques doivent être conduites différemment de par le passé pour qu'une réelle synergie puisse se développer entre elles. Il est notamment nécessaire d'étudier les processus de photoadaptation sur des organismes replacés dans un environnement artificiel mais contrôlé (dont on maîtrise les paramètres), c'est à dire susceptible de reproduire autant que possible les conditions caractéristiques d'un biotope particulier (nature des facteurs limitant, échelle de temps caractéristique de leur variation, etc.). Les multiples interactions de type proie-prédateur existant dans un réseau trophique conduisent les organismes à rétroagir sur leur propre environnement (épuisement du substrat, auto-ombrage, etc.) et à modifier les facteurs qui affectent leur croissance. Par contre, les phénomènes qui déterminent le forçage principal du réseau trophique et qui n'en subissent quasiment aucune rétroaction sont d'origine physique (advection, convection, diffusion, ondes internes, etc.). Introduire intelligemment cette composante essentielle et inaliénable du fonctionnement des écosystèmes dans des expériences de laboratoire est un réel problème conceptuel qui nécessite la contribution de physiciens. Un concertation en amont des expériences de laboratoire avec les modélisateurs est donc nécessaire.  

I.2.2. Reconstituer au laboratoire un environnement complexe pour expérimenter

Le saut qualitatif que permet ce nouveau type d'expérimentation dans l'étude des processus non linéaires caractéristiques de la photoadaptation n'est possible que si l'on parvient à reproduire un environnement dynamique, multiparamétrique, continu et instationnaire, en rupture avec les conditions d'expérimentation traditionnelle où l'étude porte généralement sur une gamme de variation discrète d'un paramètre stabilisé dans le temps. Ceci implique qu'un effort technique important soit conduit, notamment pour automatiser les contraintes apportées au système, ainsi que la mesure à haute fréquence de ses variables

I.2.2.1. Un environnement multiparamétrique

L'approche multiparamétrique est essentielle pour une étude approfondie de la photoadaptation dans un environnement où la température, les flux de photons et de nitrate interagissent dans la régulation de la synthèse pigmentaire. Ce processus a surtout été étudié en fonction du flux de photons et de la composition spectrale de la lumière dans des conditions de croissance optimale de nutriment et de température. Pourtant, parce que la synthèse de pigments et d'enzymes carboxyliques nécessite une importante mobilisation protéique, la photoadaptation est nécessairement dépendante du statut azoté des cellules. Dans quelle mesure ce dernier affecte-t-il leur capacité à optimiser leur pool de pigment est une question mal élucidée et surtout non prise en compte dans les modèles (Sciandra et al. 1997) , et qu'il faudra aborder.

La production autotrophe résulte in fine d'une synthèse protéique. L'interdépendance physiologique de la fixation de carbone et de l'assimilation de nutriment inorganique, notamment à travers la régulation pigmentaire, fait que la croissance ne peut probablement pas être une fonction simple (loi du minimum ou multiplicative) des actions conjuguées des flux de photons et de nutrilites. Pour le savoir, il faut reconstituer un environnement où ces flux sont simultanément limitants pour la croissance.

I.2.2.2. Un environnement continu et instationnaire

En s'adaptant, une cellule de phytoplancton tend, par définition, vers un état d'équilibre caractérisé par un optimum de croissance relatif aux conditions externes de lumière et de nutrilites. Si ces conditions sont elles-mêmes variables dans le temps, l'efficacité d'adaptation sera en relation avec le rapport des vitesses d'adaptation des cellules et de changement des conditions externes. Plus ce rapport sera faible, plus l'organisme se trouvera éloigné de l'état prédit par les courbes de réponse qui explicitent le taux de croissance mesuré à l'état stable en fonction du paramètre extérieur (ces relations qui sont précisément utilisées dans les modèles mathématiques). L'étude des transitoires qui accompagnent les changements d'état (par exemple le rapport q) est donc essentielle. Celle-ci n'est possible que si l'on est capable d'une part d'imposer aux cellules un environnement continuellement variable de nutriment et de lumière, et d'autre part d'en mesurer les diverses propriétés à haute fréquence.

Le forçage qui conditionne en premier lieu la physiologie algale est le cycle diurne, car il induit le cycle cellulaire (temps qui s'écoule entre la naissance et la division) au cours duquel les phases de fixation de carbone et de division sont séquentielles. Ainsi, une cellule n'utilise-t-elle qu'une partie de son cycle pour synthétiser la matière organique des cellules filles (Vaulot et al. 1987) . La production journalière est donc l'intégrale sur 24 heures de la fixation de carbone instantanée, qui est variable au cours du cycle lumineux, mais aussi au cours du cycle cellulaire. La ressource en nutriment intervient car elle peut modifier le rapport des vitesses de chacun de ces cycles. Plus ils seront déphasés, plus le bilan de production journalier sera faible. On pressent donc que l'observation à haute fréquence est importante car elle permet d'accéder à l'échelle des cycles qui conditionnent le bilan de production sur le long terme.

Ce n'est pas la seule raison. Le mode lumineux exploité par les cellules dans la colonne d'eau différera d'autant plus de la simple photopériode que le gradient vertical de lumière exploré par celles-ci sera important. Ainsi, existe-t-il une influence directe des propriétés hydrodynamiques sur la fixation de carbone à travers la plasticité du cycle cellulaire. Du point de vue de la modélisation, ceci est très intéressant car processus hydrodynamiques et cycle cellulaire peuvent être chacun identifiés par des constantes de temps caractéristiques. Par exemple, une cellule de convection peut être caractérisée par son temps de révolution moyen, de même qu'une espèce phytoplanctonique par son temps de génération. L'inverse de ces temps identifie la fréquence propre de ces systèmes en interaction. La fréquence propre de l'entité biologique peut, à travers les processus d'adaptation, s'ajuster plus ou moins bien à celle de la physique. Afin d'appréhender cette plasticité, il est nécessaire de reconstituer un environnement où les conditions de croissance sont continuellement variables, suivant un mode dicté par un schéma hydrodynamique précis.

I.2.3. Les microphénomènes sont-ils importants pour les flux résultants ?

Cette question est essentielle dans la modélisation de réseau trophique qui, à juste titre, recherche à réduire la dimension des systèmes traités. Une autre façon de poser la question est de savoir si l'on peut faire l'économie d'un représentation détaillée. Il n'y a pas de réponse univoque, suivant que l'on parle du système réel ou du modèle.

Quand on considère la réalité biologique (ou du moins ce que l'on en connaît), la question de l'importance des microphénomènes ne se pose pas, car de toute façon, ils existent. La question est plutôt de savoir si une composante émergente mesurable du système, comme la production par exemple, traduit plus l'effet moyen résultant de ces microphénomènes, ou bien leurs effets cumulés. Dans le second cas, on doit les considérer comme déterminants, et ce à deux points de vue. Ils le sont sur le bilan de matière, car une intégrale se calcule d'autant mieux que l'on a de points sur l'espace d'intégration. Ils sont également déterminants pour la trajectoire du système car celui-ci évolue incrémentalement en fonction de son état. Mais il est probable, qu'en raison de l'important forçage physique auxquels sont soumis les réseaux trophiques, lequel forçage est quasiment dépourvu de rétroaction, les trajectoires prises par le système échappent en partie à l'action des microphénomènes. Cela est une supposition qui reste à vérifier.

La question se pose aussi par rapport au modèle. Dans quelle mesure une représentation simpliste biaise-t-elle l'estimation des flux? Autrement-dit, une simple courbe de réponse (cause-effet) est-elle préférable ou non à un petit système de 3 ou 4 variables? Il n'y a pas de réponse simple, car cela dépend du forçage appliqué (à la limite, en régime stationnaire, les deux donnent le même résultat). Mais ce qui est sûr, c'est que le meilleur moyen de le savoir est de comparer les deux approches, et pour cela concevoir des modèles de processus sur la base d'expériences contrôlées.

Les effets de la lumière, des nutrilites et de la température sont mécaniquement liés à travers leur influence sur le niveau d'oxydoréduction de la chaîne de transfert d'électrons (CTE) photosynthétique. Le niveau redox des composants de la CTE est le premier signal répondant à des modifications des conditions externes, lors de la régulation pigmentaire. Il influence le processus de photoinhibition, et interfère vraisemblablement avec l'assimilation d'azote et l'excrétion de matière organique dissoute. Le niveau d'oxydoréduction est déterminé par l'équilibre (ou le déséquilibre) entre l'apport d'énergie aux centres réactionnels photosynthétiques de la cellule, et sa capacité à soutenir un niveau de photosynthèse saturé. L'apport énergétique est déterminé par le taux d'absorption de lumière et les processus de quenching se produisant dans les antennes pigmentaires et les centres réactionnels.

La régulation du cortège pigmentaire est le processus d'acclimatation qui optimise la photosynthèse et par conséquent la croissance, tout en minimisant la "photodestruction" (Schwarz et Grossman 1998). La régulation de la capacité d'absorption est supposée être contrôlée aux niveaux biochimique et génétique à travers l'état redox de la CTE (Fujita et al. 1994; Escoubas et al. 1995). Cette hypothèse s'est vue récemment renforcée expérimentalement, et un nombre croissant de réponses adaptatives sont maintenant reconnues pour être modulées par l'état d'oxydoréduction de la CTE (Kim et Mayfield 1997; Schwartz et Grossman 1998). En particulier, il a été démontré que le niveau redox régule la transcription du gène chloroplastique psbA, qui code pour la protéine D1 du centre réactionnel photosynthétique chez Chlamydomonas (Kim et Mayfield 1997). Ces résultats suggèrent la présence d'un mécanisme cohérent et général pour la régulation des gènes photosynthétiques, fondé sur l'équilibre énergétique cellulaire (état redox), et qui procure un cadre élégant pour la définition d'un modèle phénoménologique de la croissance phytoplanctonique. Cependant, l'universalité de ce mécanisme doit être testée dans le but de justifier une application à la modélisation.

En mesurant les changements d'abondance d'ARN messagers, des protéines associées aux complexes pigmentaires, et des pigments eux-mêmes, il devient possible de déterminer si les mécanismes de photoadaptation identifiés dans les algues contenant de la chlorophylle a et b et dans les chloroplastes des plantes supérieures s'appliquent également à d'autres groupes d'algues chez qui la composition pigmentaire et les antennes sont très différentes (c.a.d. les complexes phycobilisomes, fucoxanthine-chlorophylle, et péridinine). En outre, il est nécessaire d'examiner comment ce mécanisme se produit lors de régimes transitoires de lumière où une sur-réduction momentanée de la CTE peut intervenir sur des périodes allant de la milliseconde à la minute. Avec les outils de la biologie moléculaire, il est possible d'estimer les changements des pools d'ARNm, de protéines et de pigments qui résultent d'une modification de leur taux de synthèse et de dégradation, alors que l'acquisition en ligne de mesures biophysiques (fluorescence variable) permet d'estimer l'état redox de la CTE photosynthétique.

Bien qu'il existe une information importante sur la physiologie de la photosynthèse chez les algues et les cyanobactéries, celle-ci est actuellement de peu d'utilité pour une validation rigoureuse des modèles, notamment dans le cadre des conditions dynamiques existant dans le milieu naturel. A notre connaissance, la seule expérience qui possède une information appropriée permettant de tester un modèle de la réponse du rapport q à une variation dynamique de lumière a été publiée par Cullen et Lewis (1988), bien que cette expérience ait été conduite dans des conditions azotées non limitantes. Encore faut-il mentionner que cette étude ne produit pas d'informations permettant de mettre en relation les réponses photo-physiologiques et les mesures de fluorescence obtenues avec le PAM (Pulse Amplitude) ou le FRR (Fast Repetition Rate). De même, la plupart des études conduites sur la régulation pigmentaire induite par un shift lumineux souffrent d'un manque critique de données comme la concentration interne de carbone organique.

I.4.1. Définition concertée des protocoles expérimentaux pertinents

Il est nécessaire d'établir en amont de toute action une concertation entre physiciens, modélisateurs et expérimentateurs afin de définir les protocoles d'expériences au laboratoire les plus aptes à fournir des résultats utiles à la compréhension et à la modélisation de la photoadaptation, processus central dans la production primaire, et sous représenté dans les modèles d'écosystème. Le problème est de définir les modes de forçage de lumière, nutriment et éventuellement de température à spécifier en entrée aux systèmes de culture pour que les cellules phytoplanctoniques mettent en œuvre les mécanismes d'adaptation qu'elles utilisent effectivement lorsqu'elles évoluent dans une structure hydrodynamique bien définie. Les différentes situations hydrodynamiques identifiées en Atlantique Nord lors de la campagne POMME constituent un cadre idéal pour cette étude.

I.4.2. Déterminer les mécanismes mis en place lors de la photoadaptation

Il s'agit d'approfondir la connaissance phénoménologique du processus, et d'apprécier ses relations avec la croissance. Les effets synergiques de conditions variables de lumière et de nutriment sur la productivité photosynthétique seront étudiés à l'aide de méthodes biophysique et de biologie moléculaire avancées. Ces méthodes sont adaptées pour identifier les mécanismes impliqués dans la régulation de la photosynthèse au sein d'un milieu fluctuant.

·        Méthodes biophysiques et physiologiques. Les techniques de fluorescence variable de la chlorophylle seront utilisées pour quantifier les processus photo-physiologiques, en déterminant l'état photochimique opérationnel du Photosystème II, la dynamique de la capacité photosynthétique des antennes (plus précisément des LHS: light harvesting system), et la cinétique du transport d'électrons entre les complexes photosynthétiques et la membranes thylakoïde. Grâce à l'usage de fibres optiques, ces méthodes pourront être utilisées soit en ligne directement dans les chémostats soumis à des conditions de croissance variable, soit pour des mesures effectuées ultérieurement sur des échantillons en cuves optiques. Les paramètres dérivés de la fluorescence variable seront exploités pour la détermination de l'état redox du pool de plastoquinone, le détecteur supposé déclencher la réponse photoadaptative. Les bancs de détection sensible seront constitués par le Xe-PAM et le FRRF.

L'évolution de la productivité primaire brute sera suivie grâce aux techniques d'incorporation de bicarbonate marqué au ¹⁴C. Associée à d'autres paramètres issus des mesures de composition pigmentaire et de dénombrement cellulaire, cette méthode délivrera une information sur le coefficient d'utilisation optimale de la lumière a* et sur l'indice E_k de lumière saturante. Les courbes de production seront acquises grâce au "photosynthétron" développé à Villefranche (Babin 1994) .

·        Outils de biologie moléculaire et biochimique. L'expression des gènes photosynthétiques en conditions de croissance variables sera suivie en quantifiant le niveau d'ARNm pour les gènes concernés: psbA pour le centre réactionnel du Photosystème II, les gènes pour le principal complexe du LHS (lhc, pcbA ou fcp, en fonction de l'espèce étudiée), et rbcL pour l'expression d'une des grande sous-unités de la RUBISCO. Nous n'entrerons pas à ce niveau dans le détail des procédures d'électrophorèse, d'hybridation, et d'immuno-test.

I.4.3. Concevoir, tester et valider des modèles de faible dimension (3 ou 4 variables)

Il s'agit plus précisément des modèles actuellement développés à Villefranche-sur-mer en collaboration avec l'INRIA à travers le projet commun COMORE (Contrôle et Modélisation des Ressources Renouvelables). Ces modèles sont conçus pour rendre compte du comportement du rapport q et de la production dans un environnement co-limité (nitrate-lumière) et variable. Ce travail doit être abordé sous trois aspects:

1.      L'acquis phénoménologique explicité dans le précédent paragraphe doit servir à définir certains termes de ces modèles. Il s'agira par exemple de préciser si la dégradation de la chlorophylle est uniquement un processus participant à son renouvellement (dégradation passive par dilution associée à la division cellulaire), ou s'il peut être amplifié dans des conditions de stress nutritif ou lumineux (dégradation protéolytique). On recherchera à identifier dans l'ensemble des mécanismes impliqués ceux qui sont essentiels. Il s'agit bien évidemment de ne pas utiliser toute l'information extraite des expériences pour alimenter des modèles complexes surdimensionnés. Au contraire on recherchera d'une part à définir les critères permettant d'effectuer des choix de simplification dans les variables pertinentes à retenir, et d'autre part à préciser les limites d'utilisation du modèle sur la base des mécanismes retenus ou abandonnés.

2.      Il n'y a qu'en connaissant bien la complexité du système réel qu'on peut en trouver une image théorique (modèle) simplifiée. L'effort portera donc sur la recherche de la structure mathématique la plus simple (système de faible dimension avec peu de paramètres) qui rende compte des propriétés jugées indispensables pour une représentativité minimale acceptable. La définition de ce qui est acceptable ou non s'accorde sur la connaissance acquise sur le système réel, c'est-à-dire sur les données de campagne, aussi bien physiques que biologiques.

3.      La validation des modèles doit accompagner leur conception et non la suivre. Travailler la paramétrisation pour ajuster le modèle aux observations ne constitue pas une validation suffisante. Pour qu'un modèle soit structurellement validé, il est nécessaire qu'aucune des trajectoires qu'il peut produire ne sorte de ce qui est potentiellement observable sur le système réel. La proposition symétrique est qu'un système biologique ne peut pas occuper tout l'espace des états, mais que ses propriétés intrinsèques le contraignent à évoluer au sein d'un domaine spécifique de cet espace. L'étude mathématique des systèmes d'équations différentielles permet de définir ce domaine, qui, pour une grande part, est indifférent à la formulation mathématique des équations et à leur paramétrisation. Une étude structurelle du modèle permet, en amont de toute simulation, d'orienter sa définition pour que ses propriétés qualitatives satisfassent celles du système biologique. Les recherches expérimentales menées en chemostat se prêtent tout à fait à ce genre de technique, car les termes d'entrée sortie (il s'agit d'un système ouvert), que l'on peut assimiler à des termes physiques, confèrent à l'ensemble (système biologique dans le chemostat) des propriétés inhérentes particulières que les modèles doivent satisfaire impérativement.

Le développement de modèles de processus ne peut s'arrêter au stade de leur validation expérimentale, qui n'offre qu'un cadre restreint à leur application future. L'étape ultime avant leur insertion dans des structures importantes (modèles d'écosystème) nécessite un test de faisabilité et d'utilité.

Le test de faisabilité doit résoudre tous les problèmes que l'on rencontre lors du couplage d'un modèle hydrodynamique avec un modèle physique. Il est préférable d'effectuer cette opération en l'absence de toute autre variable qui ne participe pas directement au processus impliqué. Pour étudier le comportement d'un modèle de photoadaptation au sein d'une structure physique, il n'est pas nécessaire d'y inclure ni les bactéries, ni le zooplancton, car il ne s'agit bien évidemment pas, à ce stade, de reproduire le système réel. On se sert de la structure physique comme d'un chémostat: pour expérimenter sur une partie du système, ce qui simplifie grandement l'approche de validation.

Le test d'utilité doit permettre de déterminer deux choses. Premièrement le gain que procure un modèle de photoadaptation par rapport à des courbes de réponse associées par des lois empiriques (minimum, multiplicatif, etc.): le comportement où les bilans produits par ce modèle sont-ils radicalement différents du système "courbe de réponse"? La réponse n'étant probablement pas simple, il s'agira de définir la classe de modèle à utiliser en fonction du forçage hydrodynamique en vigueur. Dans tous les cas, il est importance d'estimer le biais auquel on s'expose en se contentant soit d'une représentation trop simplifiée, soit au contraire d'un modèle sur-paramétré.

 
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